魚類的急性毒性實驗

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  魚類急性毒性試驗，是水生生態毒理學的重要內容之一，并廣泛應用于水域環境污染監測工作中，對控制工業廢水的排放、保護水域環境、發展漁業生產，制定漁業水質標準，具有重要意義。

一、實驗原理

魚類對水環境的變化反應十分靈敏，當水體中的污染物達到一定程度時，就會引起一系列中毒反應，例如行為異常、生理功能紊亂、組織細胞病變、直至死亡。在規定的條件下，使魚接觸含不同濃度受試物的水溶液，實驗至少進行24h，最好以96h為一個實驗周期，在24h、48h、72h、96h時記錄實驗魚的死亡率，確定魚類死亡50%時的受試物濃度。魚類毒性試驗在研究水污染及水環境質量中占重要地位。通過魚類急性毒性試驗可以評價受試物對水生生物可能產生的影響，以短期暴露效應表明受試物的毒害性。魚類急性毒性試驗不僅用于測定化學物質毒性強度、測定水體污染程度、檢查廢水處理的有效程度，也為制定水質標準、評價環境質量和管理廢水排放提供環境依據。

二、實驗材料

1、試驗用魚的選擇與馴養

試驗用的魚必須對毒物敏感，應具有代表性，便于在實驗條件下飼養，來源豐富，個體健康。我國可采用的試驗魚有四大養殖淡水魚（青魚、草魚、鰱魚和鳙魚）、金魚、鯽魚等。

在同一實驗中要求試驗魚必須同屬、同種、同齡，最好是當年生。魚的平均體長以7cm以下為宜。金魚體短、身寬，一般以3cm以下較為合適。同組魚中最大的體長不應超過最小的體長的1.5倍。

選用的試驗魚在試驗前必須在實驗室內經過馴養，使之適應實驗室條件的生活環境和進行健康選擇。馴養魚應該與試驗相同水質水溫的水體中至少馴養7天，使其適應試驗環境，不應長期養殖（<2個月）。馴養期間，應每天換水，可每天喂食1～2次，但在試驗前一天應停止喂食，以免試驗時，剩余餌料及糞便影響水質。馴養期間試驗魚死亡率不得超過5%，否則，可以認為這批魚不符合試驗魚的要求，應該繼續馴養或者重新更換試驗魚進行馴養。

試驗前必須挑選健康的魚，即選擇行動活潑、體色光澤、魚鰭舒展完整、逆水性強、大小無太大懸殊、無任何疾病的魚作為試驗魚。任何畸形魚、外觀上反常態的魚都不得作試驗魚。

2、實驗儀器設備

（1）實驗容器

實驗容器一般用玻璃或其他化學惰性材質制成的水族箱或水槽。容器體積可根據試驗魚的體重確定，通常以每升水中魚的負荷不得超過2g（最好為1g），或者其盛水量以每條魚2～3L為宜。一些小型魚類幼魚可選擇500mL或1000mL燒杯為實驗容器。容器的深度必須超過16cm，水體表面積越大越好。同一實驗應采用相同規格和質量的容器。為防止魚類跳出容器，可在容器上加上網罩。實驗容器使用后，必須徹底洗凈，以除去所有毒性殘留物。

（2）其他

溶解氧測定儀、水硬度計、溫度控制儀、pH計、分析天平。

3、實驗用水（稀釋水）及水質條件

用來馴養和配制實驗液的水，必須是未受污染的清潔水。一般可采用天然河水、湖水或地下水，但需過濾以除去大的懸浮物質。也可用放置3天以上的自來水。如果試驗目的是評價工業廢水或化學物質對接納水體的影響時，則最好采用接納水體的污染源上游水作為試驗用稀釋水。蒸餾水不適合作稀釋水，因為蒸餾水中已除去了自然界水中的鹽類，與實際差距太大，另外由于蒸餾器的影響，有時使蒸餾水中帶有對魚類不利的金屬離子，影響試驗結果。

實驗用水的水質條件一般是指水的溫度、pH、溶解氧、硬度、水中的有機物和水量等。

（1）水溫

實驗中應保持魚類原來的適應溫度，一般冷水魚溫度為12～18，溫水魚溫度為20～28。為使得實驗結果可靠，在同一實驗中，溫度的波動范圍不要超過4（即±2）。冬天可以通過加熱室內的空氣溫度達到調節水溫的目的，也可以采用電熱棒直接控制調節水溫。

（2）pH

水的pH與水生生物的代謝作用有密切關系。對毒物的毒性作用也有一定的影響。因此，在實驗中應維持pH在魚類適宜范圍內。一般實驗液的pH在6.7～8.5為宜。如需調節pH，可用1M或0.1M的HCl和NaOH來調節受試物貯備液的pH。調節貯備液的pH時不能使受試物濃度明顯改變，或發生化學反應或沉淀。

（3）溶解氧

溶解氧是魚類生存的必要條件，它能影響魚類對毒物的敏感性。一般溫水魚要求溶解氧在4mg/L以上，冷水魚要求溶解氧在5mg/L以上。

（4）硬度

水的總硬度為10～250mg/L（以CaCO₃計）。

三、實驗步驟

1、預試驗

用確定正式實驗所需濃度范圍，可選擇較大范圍的濃度系列，如1000mg/L、100mg/L、10mg/L、1mg/L、0.1mg/L。每個濃度放入5條魚，可用靜態方式進行，不設平等組，試驗持續48h～96h。每天至少兩次記錄各容器內的死魚數，并及時取出死魚。求出24h100%死亡濃度和96h無死亡濃度。

如果依次預試驗結果無法確定正式試驗所需的濃度范圍，應另選一濃度范圍再次進行預試驗。

2、正式實驗

根據預試驗得出的結果，在包括使魚全部死亡的最低濃度和96h魚類全部存活的最好濃度之間至少設置5個濃度組，并以幾何級數排布。濃度間隔系數應≤2.2。

每個試驗濃度組應至少設2～3個平行，每一系列設一個空白對照。如使用了助溶劑，應增設溶劑對照組，其濃度與試劑中的最高溶劑濃度相同。試驗魚的數目以每組實驗濃度10～20尾合適，不得少于10尾。

試驗溶液調節至相應溫度后，從馴養魚群中隨機取出魚并隨機迅速放入各試驗容器中。轉移期間處理不當的魚均應棄除。同一試驗，所有試驗用魚應30min內分組完畢。

在24h、48h、72h、96h后檢查受試魚的狀況。如果沒有任何肉眼可見的運動，如鰓的扇動、碰觸尾柄后無反應等，即可判斷該魚已死亡。觀察并記錄死魚數目后，將死魚從容器中取出。應在試驗開始后3h或6h觀察各處理組魚的狀況，并記錄試驗魚的異常行為（如魚體側翻、失去平衡，游泳能力和呼吸能力減弱，色素沉積等）。

試驗開始和結束時要測定pH、溶解氧和溫度。試驗期間，每天至少測定一次。

至少在試驗開始和結束時，測定實驗容器中試驗液的受試物濃度。

試驗結束時，對照組的死亡率不得超過10%。

四、實驗報告

1、數據處理

以暴露濃度為橫坐標，死亡率為縱坐標，在計算機或對數概率紙上，繪制暴露濃度對死亡率的曲線。用直線內插法或常用統計程序計算出24h、48h、72h、96h的半致死濃度（LC₅₀）值，并計算95%的置信限。

如果試驗數據不適于計算LC₅₀，可用不引起死亡的最高濃度和引起100%死亡的最低死亡濃度估算LC₅₀的近似值，即這兩個濃度的幾何平均值（）。

2、化學物質急性毒性分級

依據LC50值的大小，可以將化學物質的急性毒性分為劇毒、高毒、中等毒、低毒和微毒5級。

魚類急性毒性實驗毒性分級標準

3、編寫報告

在實驗報告中應包括：試驗名稱、目的、試驗原理、試驗的準確起止日期，還有如下幾項：

（1）試驗魚的種名、來源、體重、體長、健康和馴化狀況。

（2）受試物質名稱、來源物化學性質和保存方法。

（3）實驗用水的來源、物化性質和實驗前的處理等。

（4）實驗溶液的濃度與配制方法、實驗溫度。

（5）實驗條件，如容器形式、實驗液的體積與深度、受試生物數目及負荷率。

（6）實驗開始后24h、48h、72h、96h時的LC₅₀值，及其毒性分級。

4、注意事項

（1）試驗期間，對照組魚死亡率不得超過10%。

（2）試驗期間，受試物實測濃度不能低于設置濃度的80%。如果試驗期間受試物實測濃度與設置濃度相差超過20%，則應該以實測受試物濃度來表達試驗結果。

（3）試驗期間，盡可能維持恒定條件。